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    • 专利摘要:
    本实用新型公开了mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，包括试纸条、荧光标记液和层析缓冲液，所述试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板上构成；所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；所述检测线包被有人血白蛋白抗体，所述质控线包被链霉亲和素抗体或生物素化BSA；所述荧光标记液为偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球。本实用新型工艺简单，试纸条只有两条线(C线和T线)，并未设计荧光结合垫或标记线；在检测时加入荧光标记液，避免现有技术中标记线随着存储时间延长对荧光微球的吸附增强的问题，储存周期长；同时本实用新型采用荧光标记液和尿液中的白蛋白对T线进行竞争标记，检测精度高。
    公开号:CN214334980U
    申请号:CN202022290457.4U
    申请日:2020-10-15
    公开日:2021-10-01
    发明作者:孙宏浩；朱辉；胡天星；曹泽
    申请人:Wuhan Newcando Biotechnology Co ltd；
    IPC主号:G01N33-68
    专利说明:
    [n0001] 本实用新型涉及疾病诊断检测领域，特别是一种mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒。
    [n0002] 1982年Viberti等发现糖尿病患者尿中总蛋白在正常范围，而尿白蛋白排泄增加的现象，首先提出了尿微量白蛋白(mALB)的概念。白蛋白是重要的血浆蛋白质之一，在正常情况下，白蛋白的分子量大，不能越过肾小球基膜，因此，在健康人尿液中仅含有浓度很低的白蛋白，具体到每升尿白蛋白不超过20mg，所以又被称为“尿微量白蛋白检查”。疾病时，肾小球基膜受到损害致使通透性发生改变，任何能够引起肾小球基膜通透性增高的病变，均可导致白蛋白的排出。这个时候白蛋白即可进入尿液中，尿白蛋白浓度即可出现持续升高。测定尿白蛋白最理想的方法是留取24小时尿标本，由于尿白蛋白的排泄量存在较大程度的变异，所以未定时的尿液标本(随意尿)一次白蛋白排泄量增加，可能并无意义，连续2～3次增高方有诊断价值。测定方法包括放射免疫法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。
    [n0003] 由于尿微量白蛋白相对于其他的样本来说含量很高，用双抗夹心法极易形成钩状效应，使得高浓度的检测误差增加。采用竞争法可以有效解决钩状效应。广州万孚生物技术股份有限公司的张赛等开发的万孚试剂卡(张赛等，尿微量白蛋白荧光免疫层析定量检测试剂的研制及性能评价,生物技术通报，2017,33(3)：199-204)也是采用竞争法，但是由于万孚在NC膜上采用了三条线：标记线、检测线和质控线；在标记线上喷涂的荧光微球随着存储时间的延长极易造成其吸附在检测卡上(主要是氢键、非极性键或者范德华力)，因此万孚试剂卡不但制作工艺相对繁琐，成本高，质量也不易控制。本实用新型开发的试剂卡采用两条线：检测线和质控线，检测时直接把荧光标记液和尿样直接点在加样孔或样品垫上，这样荧光标记液所偶联的白蛋白和尿样中游离的白蛋白就会一起往上层析，遇到检测线上的白蛋白抗体就会被吸附，根据尿中白蛋白的量会对荧光微球的吸附量形成竞争，未被吸附的荧光标记液会进一步被质控线吸附。
    [n0004] 本实用新型的目的在于克服现有技术的不足，提供一种mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，以解决上述技术背景中提出的问题。
    [n0005] 为实现上述目的，本实用新型通过以下技术方案来实现：
    [n0006] mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，包括试纸条、荧光标记液和层析缓冲液，所述试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板上构成；所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；所述检测线包被有人血白蛋白抗体，所述质控线包被链霉亲和素抗体或生物素化BSA；所述荧光标记液为偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球。
    [n0007] 上述技术方案中，所述层析缓冲液为pH＝7.4、浓度为0.2M的PB缓冲液，且PB缓冲液内含有0.5％的Tween-20和0.1％的proclin300。
    [n0008] 上述技术方案中，所述荧光标记液的激发波长(Ex)为500～550nm，发射波长(Em)为590～620nm。
    [n0009] 上述技术方案中，所述试纸条组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳中，塑料卡外壳的塑料上壳设有加样孔和结果显示窗，所述加样孔对应于试纸条的样品垫，所述结果显示窗对应于所述试纸条的检测线和质控线。
    [n0010] 与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：
    [n0011] (1)工艺简单，试纸条只有两条线(C线和T线)，并未设计荧光结合垫或标记线(2)本实用新型在检测时加入荧光标记液，避免现有技术中标记线随着存储时间延长对荧光微球的吸附增强的问题，储存周期长。(3)本实用新型采用荧光标记液和尿液中的白蛋白对T线进行竞争标记，检测精度高。
    [n0012] 图1为本实用新型中试纸条的结构示意图；
    [n0013] 图2为本实用新型中检测卡的结构示意图；
    [n0014] 图3为本实用新型中试纸条的检测原理图；
    [n0015] 图4为本实用新型的微量白蛋白检测标准曲线一(微量白蛋白浓度范围：0～20mg/L)；
    [n0016] 图5为本实用新型的微量白蛋白检测标准曲线二(微量白蛋白浓度范围：20～300mg/L)；
    [n0017] 图中，1、试纸条；1.1、样品垫；1.2、硝酸纤维素膜；1.3、吸水纸；1.4、聚乙烯塑料底板；2、检测线；3、质控线；4、塑料卡外壳；5、加样孔；6、显示窗。
    [n0018] 以下通过特定的具体实例说明本实用新型的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点与功效。本实用新型还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本实用新型的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
    [n0019] 需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本实用新型的基本构想，遂图式中仅显示与本实用新型中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
    [n0020] 参阅图1至图3，本实用新型提供了一种mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，包括试纸条1、荧光标记液和层析缓冲液，所述试纸条1由样品垫1.1、硝酸纤维素膜1.2、吸水纸1.3顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板1.4上构成；所述硝酸纤维素膜1.2上包被有检测线2和质控线3，具体的，硝酸纤维素膜1.2为CN95。
    [n0021] 所述检测线2(T线)包被有人血白蛋白抗体，进一步的，T线包被的抗体为鼠抗人血白蛋白15C7抗体；
    [n0022] 所述质控线3(C线)包被链霉亲和素抗体或生物素化BSA；
    [n0023] 所述荧光标记液为偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球。
    [n0024] 荧光标记液的具体制备方法为：
    [n0025] 1、荧光微球活化：以0.1mol/L MES(pH＝6.0)为缓冲液，采用EDC和NHS对荧光微球进行活化，其中EDC 1mg和NHS 1mg对应100μL荧光微球，活化时间为1h；荧光微球为市场采购，具体为的，荧光微球为表面含羧基荧光微球，激发波长(Ex)为500～550nm，发射波长(Em)为590～620nm；
    [n0026] 2、偶联：以0.01mol/L PB(pH＝7.0)为缓冲液，将活化后的荧光微球与人血白蛋白和链霉亲和素进行偶联，其中人血清人血白蛋白30μg、链霉亲和素(streptavidin下称SA)7.5μg对应100μL微球，偶联16±1h；
    [n0027] 3、封闭：采用含5％BSA的0.01mol/L PB(pH＝7.4)对步骤2中偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球封闭1h，然后加入保存液中保存，即得荧光标记液。其中，保存液包含：海藻糖10％、BSA1％、Tween-200.2％、Proclin3000.1％、Casein0.5％、甘油1％、乙二醇1％、PVP100.2％、余量为PB(10mM，pH＝7.4)；加入保存液的体积与偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球的比例关系为1：1。
    [n0028] 本实用新型中，所述层析缓冲液为pH＝7.4、浓度为0.2M的PB缓冲液，且PB缓冲液内含有0.5％的Tween-20和0.1％的proclin300。
    [n0029] 参阅图2，所述试纸条1组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳4中构成检测卡，塑料卡外壳4的塑料上壳设有加样孔5和结果显示窗6，所述加样孔5对应于试纸条1的样品垫1.1，所述结果显示窗6对应于所述试纸条1的检测线2和质控线3。
    [n0030] 本实用新型中，试纸条进行尿液检测时，层析参数为：尿液75μL/支，层析缓冲液300μL/支，荧光标记液1μL/支，层析时间15min。
    [n0031] 本实用新型的检测原理：参阅图3，将尿液、荧光标记液300加入层析缓冲液中混合均匀后，取样从加样孔5加入到样品垫1.1，然后荧光标记液300上偶联的白蛋白(即荧光微球上的白蛋白)和尿液里游离的白蛋白400就会一起往上层析，遇到T线上的白蛋白抗体100就会被吸附，尿液中白蛋白的量会对荧光标记液300(或偶联有人血白蛋白和链霉亲和素荧光微)的吸附量构成竞争；而未被吸附到T线的荧光标记液300(或偶联有人血白蛋白和链霉亲和素荧光微)会进一步被C线上的链霉亲和素抗体200吸附；这样通过T/C的比值，以及标准方程即可得到尿液中微量白蛋白的浓度。
    [n0032] 具体应用实施例1：检测尿液中尿微量白蛋白的荧光免疫层析试剂盒
    [n0033] 一、本实施例检测试剂盒
    [n0034] 1、试纸条具体制备工艺：
    [n0035] 试纸条结构：硝酸纤维素膜1.2采用CN95，裁成膜条，膜条长32mm，在膜条上划T线和C线，T线为鼠抗人血白蛋白15C7抗体，C线为羊抗链霉亲和素抗体；
    [n0036] 试纸条划线：
    [n0037] 1)划膜液组分：5％甲醇+5％海藻糖+PBS+抗体(T线为鼠抗人血白蛋白15C7抗体，C线为羊抗链霉亲和素抗体)+PBS缓冲液；鼠抗人血白蛋白15C7抗体的浓度为1μg/μL，羊抗链霉亲和素抗体的浓度为0.7μg/μL；
    [n0038] 2)划线+烘干：使用定量喷膜仪以1μL/cm的量将二者(T线和C线包被物)以5mm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜，60℃烤1天，加入干燥剂封存备用。
    [n0039] 2、所述荧光标记液为偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球，荧光微球为表面含羧基荧光微球，激发波长(Ex)为500～550nm，发射波长(Em)为590～620nm；
    [n0040] 所述层析缓冲液为pH＝7.4、浓度为0.2M的PB缓冲液，且PB缓冲液内含有0.5％的Tween-20和0.1％的proclin300。
    [n0041] 3、测试方法
    [n0042] 测试时，先将测试样本、荧光标记液加入层析缓冲液中，混合均匀后，取样层析，具体参数为：取样量为75μL，测试样本加样量75μL，荧光标记液1ul，缓冲液体积300μL，层析15min。
    [n0043] 二、制作标准工作曲线：
    [n0044] 首先，将提纯的微量白蛋白标准品用1∶100稀释的正常人血(采用pH7.20.02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为：300mg/L、200mg/L、100mg/Ll、50mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、1mg/L、0mg/L的10份样品。其次，每个样品分别用10个本实用新型中的试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，如表1和表2所述。
    [n0045] 表1不同浓度下(20～300mg/L)的T/C值
    [n0046] 浓度(mg/L) 300 200 100 50 30 20 T/C 36.3636 23.8095 11.2045 4.0519 1.6369 0.9176
    [n0047] 表2不同浓度下(0～20mg/L)的T/C值
    [n0048] 浓度(mg/L) 20 10 5 1 0 T/C 0.9176 0.3358 0.1809 0.0843 0.1246
    [n0049] 以T/C值作为X坐标，以微量白蛋白(mALB)浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计分段拟合标准工作曲线，0～20mg/L的表达式一为：y＝-23.318x2+46.219x-2.7836，拟合系数的平方为R2＝0.9997，得拟合标准工作曲线一如图4所示；20～300mg/L的表达式二为：y＝7.7988x+15.303，拟合系数的平方为R2＝0.9995，得拟合标准工作曲线二如图5所示。
    [n0050] 三、将8例收集自医院的微量白蛋白临床尿液样品进行检测，得每个样品的T/C结果，根据样本所得T/C值范围，对应代入标准工作曲线一和标准工作曲线二，得每个尿液样品中微量白蛋白(mALB)的含量，同时试验医院中常用检测方法和市场上某商业品牌微量白蛋白荧光检测试剂卡对这8个样本进行检测，统计结果具体见表3。
    [n0051]
    [n0052] 备注，表1中，“-”表示浓度太低，检测不出；“＞0.15”中0.15表示检出限，定性表示尿液中含有微量白蛋白(mALB)；
    [n0053] 由表3可知，相较于医院现有的检测尿液中微量白蛋白方法，本实用新型所得检测试剂盒，不仅可以检出是否含有微量白蛋白，还给出了每份样本的最终准确浓度。同时本实用新型检测样本的阴阳性与某商业品牌检测试纸卡所检测的结果相一致。
    [n0054] 具体应用实施例2：
    [n0055] 对临床样品进行检测。将60例收集自医院的微量白蛋白临床尿液样品(其中阳性48份，阴性12份)同时用胶体金免疫层析试纸与本实用新型提供的试纸条进行检测：
    [n0056] 胶体金免疫层析试纸法——40份阳性，20份阴性(即8份阳性漏检)；
    [n0057] 本实用新型提供检测试剂盒与仪器法——48份阳性，12份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，本实用新型提供检测试剂盒与仪器法给出了每份样品的最终准确浓度。
    [n0058] 以上所述实施例仅表达了本实用新型的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。
    权利要求:
    Claims (4)
    [0001] 1.mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条(1)、荧光标记液和层析缓冲液，所述试纸条(1)由样品垫(1.1)、硝酸纤维素膜(1.2)、吸水纸(1.3)顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板(1.4)上构成；所述硝酸纤维素膜(1.2)上包被有检测线(2)和质控线(3)；所述检测线(2)包被有人血白蛋白抗体，所述质控线(3)包被链霉亲和素抗体或者生物素化BSA或生物素化BSA；所述荧光标记液为偶联人血白蛋白和链霉亲和素的荧光微球。
    [0002] 2.根据权利要求1所述的mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，其特征在于，所述层析缓冲液为pH＝7.4、浓度为0.2M的PB缓冲液。
    [0003] 3.根据权利要求1所述的mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记液的激发波长(Ex)为500～550nm，发射波长(Em)为590～620nm。
    [0004] 4.根据权利要求1所述的mALB荧光免疫层析定量检测试剂盒，其特征在于，所述试纸条(1)组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳(4)中，所述塑料卡外壳(4)的塑料上壳设有加样孔(5)和结果显示窗(6)，所述加样孔(5)对应于试纸条(1)的样品垫(1.1)，所述结果显示窗(6)对应于所述试纸条(1)的检测线(2)和质控线(3)。
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